Estimado Miguel:
Creo que este artículo puede servirte. Entiendo que si bien es cierto
las uvas contienen resveratrol entre otros compuestos, que son muy
saludables y que efectivamente son muy útiles en dietas desintoxicantes, en
el vino, la fermentación y el tiempo que permanece el orujo en contacto
con el mosto, se producen reacciones que potencian algunos efectos
sobre la capacidad antioxidante.
Igual que Sacha, creo que no es bueno fomentar el consumo de vino, en
nuestros países donde el alcoholismo es un problema país, pero también
hay que ser justos con las cualidades del vino, especialmente el tinto.
Cariños
Lic. Nut. Nelba Villagran
Creo que este artículo puede servirte. Entiendo que si bien es cierto
las uvas contienen resveratrol entre otros compuestos, que son muy
saludables y que efectivamente son muy útiles en dietas desintoxicantes, en
el vino, la fermentación y el tiempo que permanece el orujo en contacto
con el mosto, se producen reacciones que potencian algunos efectos
sobre la capacidad antioxidante.
Igual que Sacha, creo que no es bueno fomentar el consumo de vino, en
nuestros países donde el alcoholismo es un problema país, pero también
hay que ser justos con las cualidades del vino, especialmente el tinto.
Cariños
Lic. Nut. Nelba Villagran
POLIFENOLES DEL VINO Y SALUD HUMANA
Dr. Federico Leighton y Dra. Inés Urquiaga
Publicado en Antioxidantes y calidad de vida 2000; 7: 5-13.
Organo de difusión del South American Group for Free Radical Research
Introducción
El vino ha sido parte de la cultura humana desde hace unos 6.000 años. Antecedentes históricos relacionan al vino con salud y longevidad y esto se destaca en la cultura mediterránea. Efectivamente en Francia y otros países del área mediterránea (España, Portugal, Italia, Grecia y Yugoslavia) el vino está integrado al comportamiento habitual de estos pueblos, que lo consumen con las comidas y en celebraciones.
En los últimos diez años han surgido una serie de estudios científicos que muestran que beber moderadamente es beneficioso para la salud, en especial para la prevención de la enfermedad coronaria. El interés por estudiar el vino aumenta notablemente luego de una investigación realizada por la organización mundial de la salud, el proyecto Mónica, en 1989 1. Este trabajo confirmó que las tasas de mortalidad por enfermedades cardiovasculares en Francia eran mucho menores que en otros países industrializados como USA y el Reino Unido. Este hecho se presenta pese a que el consumo de grasas saturadas (14-15% del aporte energético) y los niveles de colesterol plasmático son similares tanto en Francia como en USA y el Reino Unido. A esta situación se le llamó Paradoja Francesa. Otros factores de riesgo como cigarrillo o presión arterial no daban cuenta de esta diferencia. La explicación se buscó en la dieta de los franceses, de tipo mediterránea, rica en frutas, verduras y vino. Las investigaciones le atribuyen un papel clave al consumo moderado de vino en la dieta de los franceses, por su alto contenido en compuestos polifenólicos naturales antioxidantes 2-5.
La evidencia actual demuestra que patologías crónicas como ateroesclerosis, artritis, demencias y cáncer están asociadas a estrés oxidativo. Los compuestos antioxidantes ingeridos por la dieta serían fundamentales para la prevención de estas enfermedades. Los polifenoles del vino protegerían, por ejemplo, a las LDL (lipoproteínas de baja densidad) de la oxidación, y por lo tanto de la iniciación del proceso de ateroesclerosis.
En este trabajo se presenta una revisión de la información acumulada en relación a los componentes del vino, su capacidad antioxidante y su efecto sobre distintos parámetros bioquímicos y fisiológicos en estudios de intervención en humanos.
Polifenoles
Los polifenoles son un gran grupo de compuestos presentes en la naturaleza que poseen anillos aromáticos con sustituyentes hidroxilos. Estos compuestos son en su mayoría potentes antioxidantes por su estructura química (donador de H+ o electrones) necesarios para el funcionamiento de las células vegetales; que se encuentran en frutas y verduras, por ejemplo, manzanas y cebollas, y en bebidas como té y vino 6 .
Se clasifican de acuerdo con el número de átomos de carbono del esqueleto base. En la Tabla 1 se presentan los principales polifenoles identificados en nuestra dieta.
| Tabla 1: Principales tipos de compuestos fenólicos en plantas. | ||||
Atomos de Carbono | Esqueleto | Tipo | Ejemplos presentes en vino | |
| | | | | |
| 6 | C6 | Fenoles Simples | | |
| | | Benzoquinonas | | |
| | | | | |
| 7 | C6 - C1 | Acidos Fenólicos | Acido Gálico | |
| | | | | |
| 8 | C6 - C2 | Derivados de Tirosina | Tirosol | |
| | | Acidos Fenilacéticos | | |
| | | | | |
| 9 | C6 - C3 | Acidos cinámicos | Acido Cafeico | |
| | | Fenilpropenos | | |
| | | Cumarinas | | |
| | | | | |
| 10 | C6-C4 | Naftoquinones | | |
| | | | | |
| 13 | C6 -C1-C6 | Xantonas | | |
| | | | | |
| 14 | C6- C2-C6 | Estilbenos | Resveratrol | |
| | | Antraquinones | | |
| | | | | |
| 15 | C6-C3-C6 | Flavonoides | Quercetina | |
| | | Isoflavonoides | Cianidina | |
| | | | Catequina | |
| | | | Miricetina | |
| | | | Malvidina | |
| 18 | (C6-C3)2 | Lignanos | | |
| | | Neolignanos | | |
| | | | | |
| 30 | (C6-C3-C6)2 | Bioflavonoides | | |
| | | | | |
| n9 | (C6-C3)n | Ligninas | | |
| | | | | |
| n6 | (C6)n | Melaninas Catecolicas | | |
| | | | | |
| n15 | (C6-C3-C6)n | Taninos Condensados | Procianidina | |
| | | | | |
| | | | | |
En estudios in vitro, muchos polifenoles naturales son mejores antioxidantes que las vitamina E y C. Además, su capacidad de quelar metales, especialmente cobre y hierro, los hace actuar indirectamente como antioxidantes ya que inhiben la acción de los metales como catalizadores en la formación de radicales libres 7.
Figura 1: Estructura de compuestos flavonoides C6-C3-C6. La estructura básica de los flavonoides se denomina 2-fenilbenzopirona y consiste en la fusión de los anillos A y C, con un anillo de fenilo unido a la posición 2 del anillo C. Las variaciones estructurales en los anillos subdividen a los flavonoides en varias familias.
Flavonol | R | R' | | | | ||
| | H | H | | | Quempferol | ||
| | OH | H | | | Quercetina | ||
| | | | | | | ||
Flavan-3-ol | R | R' | | | | ||
| | OH | OH | | | Catequina | ||
| | | | | | | ||
Flavona | R | R' | | | | ||
| | H | H | | | Apigenina | ||
| | OH | H | | | Luteolina | ||
| | | | | | | ||
Antocianidina | R | R' | | ||||
| | OH | H | Cianidina | ||||
| | OCH3 | OCH3 | Malvidina | ||||
Se han descrito más de 4.000 flavonoides (C6-C3-C6) diferentes los que se clasifican en varias familias según cambios en su estructura básica, Figura 1. Poseen varios grupos hidroxilo (HO.) unidos a su estructura de anillos y se encuentran normalmente como glicósidos 8.
Los flavonoides son parte de nuestra dieta, en un estudio realizado en una población Holandesa se estimó una ingesta diaria de aproximadamente 26 mg/día 9,10. Además, se han comunicado estudios epidemiológicos que asocian el consumo de flavonoides con menor mortalidad general y menor mortalidad por enfermedad coronaria 10.
Los flavonoides ejercen numerosos efectos bioquímicos, aparentemente beneficiosos, además de su acción como antioxidantes. In vitro poseen actividades anti-inflamatoria, antialérgica, antitrombótica, antimicrobiana y antineoplásica 11-13. Sin embargo, la extrapolación de resultados in vitro a lo que ocurre en un organismo in vivo, sólo es posible cuando se conoce la biodisponibilidad del compuesto activo, vale decir cuando se sabe que es estable en el tubo digestivo, que se absorbe, y que alcanza niveles circulantes significativos. Los estudios de biodisponibilidad de polifenoles son muy escasos y no permiten aún conclusiones definitivas.
Compuestos polifenólicos en el vino
La composición del vino es compleja (Tabla 2). El número de compuestos identificados en el vino se ha incrementado enormemente gracias al desarrollo de nuevas tecnologías analíticas. Existen aproximadamente 500 compuestos conocidos presentes en el vino, de los cuales 160 son ésteres. La mayoría de sus componentes provienen de la uva y del proceso fermentativo.
Los compuestos polifenólicos de la uva se encuentran en la piel, especialmente en las células epidérmicas, y en las pepas; su concentración es baja en la pulpa (Figura 2). La cantidad y calidad de polifenoles en la uva depende principalmente de la variedad de la vid, del clima, del terreno y de las practicas de cultivo 14. Los principales constituyentes fenólicos del vino con capacidad antioxidante son: derivados de ácidos fenólicos, ácidos cinamicos y tirosina; estilbenos, flavonoides y procianidinas (Tabla 1, Figura 1).
Figura 2: Distribución esquemática de los polifenoles en un grano de uva tinta de Vitis vinífera como Cabernet Sauvignon. Los polifenoles están en un 10% en el jugo, 30% en la piel y 60% en las pepas.
Tabla 3: Concentración en mg/L de algunos constituyentes polifenólicos del vino
Vino | Tinto | Blanco | B/T |
| Acido Gálico | 95 | 7 | 0.07 |
| Catequina | 191 | 35 | 0.18 |
| Epicatequina | 82 | 21 | 0.26 |
| Acido Cafeico | 7.1 | 2.8 | 0.39 |
| Cianidina | 2.8 | 0.0 | 0.00 |
| Malvidina 3-gluc. | 23.5 | 1.0 | 0.04 |
| Rutina | 9.1 | 0.0 | 0.00 |
| Miricetina | 8.5 | 0.0 | 0.00 |
| Quercetina | 7.7 | 0.0 | 0.00 |
| Resveratrol | 1.5 | 0.03 | 0.02 |
Expresados como
La concentración total de compuestos polifenólicos en el vino varía entre 1,80 y 4,06 g/L equivalentes en ácido gálico, con un promedio de 2,57 g/L para vino tinto, y de 0,16 a 0.33 g/L, con un promedio de 0.24 g/L, para el vino blanco 15.
Las variedades de uva que se emplean para la producción de vinos tintos y blancos son distintas. Si bien el contenido de polifenoles en la uva depende de los factores ya mencionados, la diferencia en el proceso de vinificación es la principal razón por la cual los vinos tintos y blancos tienen esta enorme diferencia en la cuantía de polifenoles. El vino tinto se prepara a partir del grano de uva completo; es decir a partir de la pulpa, la piel y las pepas. El vino blanco se hace sólo con el jugo de la uva, separándose al inicio del proceso la piel y las pepas, es decir antes de la fermentación.
Los estudios de cuantificación y caracterización de los distintos compuestos fenólicos en vino tinto y blanco (Tabla 3) muestran que estos están más concentrados en el vino tinto que en el blanco.
Catequina es el compuesto fenólico monomérico más abundante seguido de ácido gálico, en el vino tinto. El ácido gálico proviene principalmente de la hidrólisis de ésteres de flavonoides, presentes en la piel y en las pepas de las uvas.
Los niveles de epicatequina son menores que los de catequina en la mayoría de los vinos.
Las concentraciones de ácido cafeico son relativamente bajas tanto para vino tinto como blanco. El ácido cafeico es producto de la hidrólisis del ácido caftárico, siendo la inducción de la hidrólisis dependiente de la exposición al sol 16.
Las antocianidinas, cianidina y malvidina, están presentes en cantidades relativamente altas en el vino tinto, entre 0-7 mg/L y 0-90 mg/L respectivamente 15. Son las principales responsables de su color.
El contenido total de flavonoles, considerado como la suma de miricetina y quercetina, en vinos tinto varía entre 4,6 y 41,6 mg/L17. Miricetina y quercetina se encuentran libres o conjugados, la proporción de flavonoles libres varía entre un 20-50% del total.
Los glicósidos de quercetina se acumulan en la piel de las uvas negras 16 , por lo tanto los vinos provenientes de uvas negras de piel gruesa con una alta proporción de piel en relación con su volumen como Cabernet Sauvignon, contienen concentraciones más altas de flavonoles. La maduración de las uvas lleva a una creciente acumulación de flavonoles 16.
La concentración de resveratrol, uno de los polifenoles del vino que más atención ha concitado, puede variar entre 0,003 y 3,0 uM en vino tinto 14,18. Debido a que el resveratrol es un compuesto que actúa como fungicida y es inducido por infecciones, su presencia y niveles pueden ser muy variables 15.
Capacidad antioxidante del vino
Se han empleado distintos métodos para evaluar la capacidad antioxidante de mezclas complejas como vino, extracto de tejidos o fluido biológico. No existe un método único y los índices obtenidos para una muestra dependen del procedimiento utilizado para evaluarla. Es necesario considerar que las determinaciones de la capacidad antioxidante realizadas in vitro nos dan sólo una idea aproximada de lo que ocurre en situaciones complejas in vivo. Por otra parte, la capacidad antioxidante de una mezcla, no está dada solo por la suma de las capacidades antioxidantes de cada uno de sus componentes; también depende del microambiente en que se encuentra el compuesto. Los compuestos interactúan entre si pudiendo producirse efectos sinérgicos o inhibitorios. Habitualmente las diferentes mediciones se expresan en equivalentes de vitamina E, usando TROLOX (análogo soluble de vitamina E).
Algunos de estos indices se indican a conticuación, cuyos valores dependen del método empleado en la medición.
El índice TRAP, Potencial Antioxidante Total, corresponde a la cantidad de radicales libres que pueden ser atrapados por una muestra que contenga antioxidantes. Mide principalmente la cantidad y no la calidad de los antioxidantes presentes en la muestra; sin mayor diferencia según la reactividad de los antioxidantes estudiados 19.
Indice TAR, Reactividad Antioxidante Total, es la concentración de radicales libres que pueden ser inicialmente atrapados por la muestra. Depende de la cantidad y reactividad de los antioxidantes presentes en la muestra 19.
Indice TAA, Actividad Antioxidante Total, es un procedimiento intermedio entre TRAP y TAR que refleja la cantidad y reactividad de los antioxidantes presentes en la muestra.
La inhibición de la oxidación de las LDL es otra forma de evaluar la capacidad antioxidante de distintos compuestos y mezclas complejas. Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición de la oxidación de las LDL respecto al control, o bien se calcula la concentración del compuesto para tener un 50 % de inhibición (IC50) en base a una curva de concentración.
El contenido total de polifenoles de un vino correlaciona directamente con su capacidad antioxidante 8,20. En la Tabla 4 se presenta un resumen de valores de capacidad antioxidante para vinos tintos y vinos blancos obtenidos por diferentes grupos utilizando distintos procedimientos 21.
| Referencia | Indice | Sistema | Vino Tinto | Vino Blanco |
| (1996)21 | TRAP | Blanqueamiento de radicales cationicos ABTS | 29.1 ± 2.3 mM* (n = 10) | 4.2 ± 1.2 mM* (n = 3) |
| (1996)21 | TAR | Luminol/ABAP | 35 ± 2 mM* (n = 2) | 5.5 mM* (n = 1) |
| Whitehead (1995)22 | TRAP | Luminol/Peroxidasa | 15.4 ± 3.4 mM* (n = 9) | 1.1 ± 0.2 mM* (n = 4) |
| Rice-Evans (1997)8 | TAA | Ferrilmioglobina/ABTS | 16.7 mM* (n = 6) | |
| Ghiselli (1998)23 | TRAP | R-ficoeritrina/AAPH | 7.8 mM* (n = 1) | |
| Sato (1996)20 | SOSA | Hipoxantina-xantina oxidasa | 286.5 – 1122 U/mL (n = 23) | 39.3 – 215.9 U/mL (n = 7) |
*Valores expresados mM equivalentes Trolox
Complementariamente, se ha determinado la capacidad antioxidante de los distintos compuestos puros, basándose en la composición de polifenoles en el vino y datos de actividades antioxidantes equivalentes Trolox (TEAC) de polifenoles puros, calcularon la contribución de cada componente del vino a la capacidad antioxidante de este 8,15. Haciendo este cálculo se encuentra que sólo se puede justificar un 25% de la capacidad antioxidante del vino. Es necesario tomar en cuenta que los polifenoles identificados por Frankel y col.15, solo representan una pequeña proporción del total de polifenoles del vino, indicando que compuestos no identificados, otros polifenoles, acidos fenólicos y posiblemente polímeros, contribuyen en forma importante al TAA del vino tinto.
En relación a los trabajos en que se ha evaluado la capacidad antioxidante del vino mediante su efecto sobre la oxidación de las LDL, todos ellos demuestran que los componentes fenólicos del vino inhiben la susceptibilidad de las LDL a la oxidación, in vitro 6,15,24-,27. En nuestro laboratorio hemos demostrado que catequina y vino, son capaces de proteger a las LDL de la oxidación. Estudios similares muestran que catequina es incluso más efectiva que la vitamina E 28,29.
Frankel y col. 15, encontraron que el porcentaje relativo de inhibición de la oxidación de las LDL en 20 vinos Californianos varía entre 46 y 100% en vinos tinto y entre 3 y 6 % en vinos blanco. Comparados a la misma concentración de fenoles totales (equivalente a 10 uM ácido gálico) los porcentajes de inhibición varían entre 37 y 65 % en vinos tinto y entre 27 y 46 % en blancos. La actividad antioxidante relativa de estos vinos correlaciona con el contenido de fenoles totales (r = 0,94) y con la concentración de ácido gálico (r = 0,92), catequina (r =0,76), miricetina (r = 0,70), quercetina (r = 0,68), ácido cafeico (r = 0,63), rutina (r = 0,50), epicatequina (r = 0,45), cianidina (r = 0,43), y malvidina 3-glucosido (r = 0,38). Esto muestra que cada componente fenólico contribuye en forma diferente en la capacidad antioxidante del vino.
Otros autores han analizado distintas fracciones del vino con el fin de identificar los compuestos polifenolicos responsables de esta capacidad. En la Tabla 5 se presenta un resumen de algunos estudios realizados utilizando diferentes métodos de extracción y análisis, y procedimientos para evaluar capacidad antioxidante en distintas fracciones de vino. Los resultados de estas investigaciones sugieren que las antocianinas en el vino tinto tendrían un papel principal en su efecto protector como antioxidante.
Tabla 5: Resumen de los resultados obtenidos en algunos estudios realizados en distintas fracciones de vino tinto utilizando diferentes métodos de extracción y análisis y procedimientos para evaluar capacidad antioxidante.
Referencia | Fraccionamiento | Sistema | Resultado |
| Abu-amsha (1996)25 | Cromatografía en capa fina | Oxidación LDL | Las dos fracciones con mayor actividad no tenían flavonoides; en ellas identificaron ac.cumárico, ac. caféico y ac.protocatecuico. Ac. cumárico resultó ser inactivo. |
| Baldi (1996)30 | Extracción líquido/líquido | Espectroscopia EPR (O2.) | Fracciones que contienen compuestos de menor PM tienen mayor capacidad antioxidante que las que tienen mayor PM |
| Ursini (1996)31 | Cromatografía en columna | "Crocin Bleaching Inhibition" | La capacidad antioxidante del vino tinto se debe en un 55% antocianinas, 25% taninos, 15%flavonoles; 5%ac.fenólicos hidrosolubles |
| Kerry (1997)32 | Cromatografía en columna | Oxidación LDL mediada por Cu | La fracción que contiene antocianinas y catequinas es la mas activa; la sigue la de ac. fenólicos; flavonoles y procianidinas |
| Ghiselli (1998)23 | Extracción líquido/líquido | R-ficoeritrina/ AAPH | La fracción que contiene las antocianinas es la mas activa. Las otras dos fracciones que contienen ac. fenólicos y quercetina-3-glucurónido; y procianidinas, catequinas y quercetina-3-glucosido son menos activas. |
ESTUDIOS DE INTERVENCION EN HUMANOS
Consumo Agudo
Algunos investigadores han estudiando el efecto del consumo agudo de vino sobre la capacidad antioxidante del plasma y otros paralelamente han intentado identificar polifenoles en el plasma. En la Tabla 6 se resumen estos resultados.
Tabla 6: Efecto del consumo agudo de vino sobre la capacidad antioxidante del plasma. Resumen de resultados publicados.
| Referencia | Protocolo | Resultado |
| Whitehead (1995)22 | -300 ml vino tinto (17mM eq Trolox) en ayunas -300 ml vino blanco (1,1mM eq Trolox) en ayunas | -Cap. Antiox. del plasma aumenta. a los 60 min en 18%. -Cap. Antiox. del plasma pequeño aumento no significativo |
| Maxwell (1996)33 | -380 ml vino tinto (11,4mM eq Trolox) con una comida estándar | -Cap. Antiox. del plasma aumenta con un máximo a los 90 min en 15% |
| Ursini (1996)31 | -300 ml vino tinto (42mM eq Trolox) en ayunas | -Cap. Antiox. del plasma aumenta entre 51% y 117% según individuo |
| Day (1997)34 | -125 ml jugo concentrado de uva tinta (31mM eq Trolox) | -Cap. Antiox. del plasma aumenta a los 60 min en 8% |
| Leighton (1997)28 | -400 ml vino tinto con una comida estándar | -Cap. Antiox.(TRAP) del plasma aumenta a los 103 min en 15,3% la que permanece por 2,5 hrs -Cap. Antiox.(TAR) del plasma aumenta a los 68 min en 47,2% |
| Serafini (1998)35 | -113 ml vino tinto desalcoholizado (40mM eq Trolox) en ayunas -113 ml vino blanco desalcoholizado (1,9mM eq Trolox) en ayunas | -Cap. Antiox. del plasma aumenta a los 50 min en 14% -Cap. Antiox del plasma no aumenta |
En nuestro laboratorio estudiamos en voluntarios en ayunas el efecto del consumo de 250 ml de vino tinto durante 30 minutos, con una comida estándar. Se les tomaron muestras de sangre a intervalos durante 4 horas. Se determinaron en el plasma por HPLC utilizando un detector electroquímico, tocoferol, caroteno, licopeno y ubiquinol. Por espectrofotometría se midieron ascorbato y TBARS en plasma, y glutatión en sangre. Catequina, epicatequina, miricetina y quercetina se cuantificaron por HPLC usando detector electroquímico y arreglo de diodos. TRAP y TAR por quimioluminicencia, además de un perfil bioquímico. No se encontraron diferencias en las concentraciones de tocoferol, caroteno, licopeno, ubiquinol, ascorbato, glutation y TBARS después de la ingestión de vino. Catequina, quercetina, miricetina y epicatequina mostraron un aumento transitorio aproximadamente a los 38 minutos, con un máximo del orden de 152 ug/L, 117 ug/L, 39 ug/L y 23 ug/L respectivamente. La capacidad antioxidante del plasma, medida como TRAP, aumentó a partir de los 68 minutos estabilizándose a los 90 minutos en 332 uM equivalente Trolox. Es decir, TRAP alcanzó un aumento de un 15.3% respecto al basal a partir de los 103 minutos manteniendose en el tiempo durante por lo menos 2,5 horas. A su vez, la reactividad antioxidante total del plasma, medida como TAR, aumentó marcadamente en 105 uM equivalente Trolox a los 68 minutos manteniéndose estable durante una hora, para luego comenzar a decaer paulatinamente. Es decir, TAR aumentó un 47.2% a los 68 minutos disminuyendo lentamente sólo después de los 131 minutos (Figura 3).
Figura 3: Reactividad antioxidante total (TAR) en el plasma de un sujeto suplementado con vino tinto (250 ml) y una comida estándar durante 30 minutos. Las muestras de sangre se tomaron antes, 0 minutos, y después de la suplementación 30, 60, 90, 120, 180 y 240 minutos. Los TAR se determinaron usando ABAP como fuente de radicales libre en presencia de luminol a 37°C . Los valores están expresados en equivalentes Trolox (Datos no publicados, mediciones realizadas por Druso Pérez).
Los resultados muestran un desfasaje temporal entre el aumento de los flavonoides cuantificados y el aumento de la capacidad antioxidante del plasma. Esto indica que los flavonoides estudiados no son los principales responsables del cambio en la capacidad antioxidante del plasma luego de la ingestión de vino. Probablemente, otros polifenoles presentes en el vino serian mas importantes que los estudiados.
Estas investigaciones demuestran que la ingestión de vino tinto está asociada a un aumento de la capacidad antioxidante del plasma, la cual sería función de la velocidad de absorción de los distintos polifenoles. La forma en como se absorben estos compuestos no está totalmente clara, hay evidencias que agliconas y compuestos fenólicos simples, pueden ser absorbidos directamente por la mucosa gastro intestinal. Por consiguiente, los glicósidos deberían ser hidrolizados a su correspondiente aglicona antes de ser absorbidos, siendo necesaria la participación de la flora intestinal para producir la hidrólisis de estos compuestos 36 . Las agliconas absorbidas serían metiladas y/o conjugadas con ácido glucurónico o sulfatadas, en el hígado 37. Sin embargo, también hay evidencias que glicósidos propiamente tal pueden ser absorbidos por el intestino delgado 37. Se ha visto que distintos glicósidos de quercetina muestran grandes diferencias en su velocidad de absorción y biodisponibilidad 38.
Consumo de Largo Plazo
El consumo moderado y regular de bebidas que contienen alcohol aumenta la concentración de colesterol HDL en el plasma, siendo este uno de los mecanismos de protección postulado para este tipo de bebidas, en la disminución de la mortalidad cardiovascular 38,39. Puesto que el vino tinto contiene polifenoles antioxidantes que inhiben la oxidación de las LDL in vitro, algunos investigadores han buscado los mecanismos de acción del vino tinto sobre las LDL in vivo.
Fuhrman y colaboradores 41, en Israel, evaluaron la susceptibilidad del plasma humano y de las LDL a la peroxidación lipídica en 17 sujetos que recibieron 400 ml de vino tinto o vino blanco con las comidas, durante dos semanas. Estos autores encontraron que las LDL de aquellos voluntarios que bebieron vino tinto pero no blanco eran más resistentes a la oxidación. Las observaciones de este grupo apoyan una comunicación preliminar de Kondo y colaboradores 42, quienes encontraron que el consumo de vino tinto y no de vodka, es capaz de modificar las LDL aumentando su resistencia a la oxidación.
Sin embargo, de Rijke y colaboradores 43 no detectaron diferencia en la oxidación de las LDL luego de suministrar 550 ml diarios de vino blanco o tinto con un bajo contenido alcohólico, 3,5%, a voluntarios durante cuatro semanas.
Recientemente, Nigdikar y colaboradores 44, realizaron un estudio con el fin de explicar las discrepancias entre los dos estudios anteriores. Investigaron el efecto de la ingesta de 375 ml diarios de vino tinto o blanco, 1 g diario de polifenoles de vino tinto en capsula (equivale a 375 ml de vino tinto), 1 g diario de polifenoles de vino tinto disueltos en vino blanco y 40 g de etanol diarios en grupos de 6 a 9 voluntarios durante dos semanas. Encontraron que las LDL de los voluntarios que ingirieron vino tinto, polifenoles de vino tinto en cápsulas y polifenoles de vino tinto disuelto en vino blanco eran mas resistentes a la oxidación que las LDL de los voluntarios de los otros grupos, y que estas diferencias resultaron ser estadísticamente significativas. Además, estos mismos voluntarios presentaron una disminución de las sustancias reactivas al ácido tiobarbiturico, peroxidación lipídica, y dienos conjugados en el plasma y un aumento del contenido en polifenoles tanto en el plasma como en las LDL. Estos autores demuestran que diferencias en los procedimientos de purificación de las LDL conducen a diferencias en los resultados. Por lo tanto lo mas probable es que la imposibilidad de algunos investigadores de observar el efecto del consumo de vino se deba a la aplicación de técnicas diferentes 45.
Otro de los mecanismos propuestos para justificar el papel antiaterogénico de las bebidas alcohólicas es a través de su capacidad de disminuir la coagulación de la sangre, es decir por un mecanismo antitrombótico 46. Se ha observado que el efecto inmediato del alcohol, luego de 10 a 20 minutos de la ingestión, es el de disminuir la agregación plaquetaria frente a distintos agonistas (trombina, ADP, epinefrina, colageno). Sin embargo, después de varias horas o al día siguiente en bebedores moderados y regulares, la respuesta fue variable y poco clara 47,48. Por otro lado, se ha observado que en bebedores exagerados al cesar brúscamente el consumo se produce un aumento de la agregación plaquetaria por un mecanismo de rebote de las plaquetas. Este fenómeno no se observa en quienes han consumido vino, atribuyéndosele a las procianidinas la capacidad de controlar el rebote de la actividad plaquetaria.
A la luz de estas evidencias nosotros realizamos un estudio de intervención en humanos con la intención de evaluar los cambios bioquímicos y fisiológicos inducidos por dietas ricas o pobres en antioxidantes naturales y el efecto adicional de la suplementación con vino. El estudio se realizó en dos grupos de 21 hombres. A un grupo se le proporcionó dieta rica en grasas. En la que el 41,4% de las calorías provenían de las grasas, el 17,9 % de las proteínas y el 40,7% de los carbohidratos. Esta dieta consideró el consumo de 240 g diarios de frutas y verduras. Al otro grupo, en tanto, se le proporcionó una dieta tipo mediterránea. En ella solo un 25,5% de sus calorías provenían de las grasas, un 16,7% de las proteínas y un 57,5% de los carbohidratos. Este grupo consumió 675 g al día de frutas y verduras, grasa monoinsaturada en aceite de oliva –de hecho el 53,1% de los ácidos grasos eran monoinsaturados-, consumió menos carnes rojas y más pescado y pollo que el otro grupo.
El estudio duró 90 días. Durante treinta días los voluntarios consumieron sus dietas respectivas. Luego, entre el día 31 y 60 ambos grupos consumieron, además de su dieta, una porción diaria de 240 ml de vino tinto. En los treinta días siguientes se suprimió el vino y se mantuvieron las dietas. Los participantes permanecieron bajo estricta vigilancia médica y nutricional. A los 0, 30, 60, y 90 días, a cada individuo, se le realizó un control médico y se le tomó muestras de sangre y orina. Se estudiaron un total de aproximadamente 350 variables distintas en cada tiempo. Evaluamos, entre otros, capacidad antioxidante del plasma, polifenoles plasmáticos, daño oxidativo al DNA y función endotelial. En general los resultados obtenidos muestran que tanto el consumo de frutas y verduras, como el consumo moderado de vino es beneficioso para la salud. Y que una dieta rica en grasas induce un aumento en el estrés oxidativo.
En relación a los antioxidantes plasmáticos, encontramos que vitamina C aumentaba luego de la ingesta de vino en ambos grupos, siendo significativo solo para el grupo de la dieta tipo mediterránea; la vitamina E disminuía significativamente luego de la ingesta de vino en ambos grupos; ß-caroteno no se modificó en ningún caso.
Capacidad Antioxidante del Plasma
Los valores obtenidos para la capacidad antioxidante total del plasma, medida como TAR, se muestran en la Tabla 7. En el grupo dieta tipo mediterránea, TAR aumenta a los 30 días por efecto de la dieta en un 28%,y luego de la suplementación con vino, a los 60 días, en un 56% respecto al día 0. En el grupo dieta rica en grasas, se observa un aumento solo luego de la suplementación con vino de un 23% sobre los valores basales.
Comparando ambos grupos, los valores para el grupo dieta tipo mediterránea son mayores que los del grupo dieta rica en grasas, en un 29%, 37% y 31% a los días 30, 60 y 90, respectivamente (p < 0.003). Claramente la dieta tipo mediterránea induce un aumento en la capacidad antioxidante del plasma. Por otro lado la suplementación con vino aumenta la capacidad antioxidante del plasma tanto en el grupo dieta mediterránea como en el grupo dieta rica en grasas.
Tabla 7: Efecto de la dieta rica en grasas, dieta tipo mediterránea y el consumo moderado de vino tinto sobre la capacidad antioxidante del plasma (TAR) (µM equivalente Trolox)
Tiempo (días) | 0 | 30 | 60 | 90 |
Dieta rica en grasas | 230 ± 34a | 246 ± | 282 ± 72b | 254 ± 85ab |
Dieta tipo Mediterránea | 248 ± 35a | 317 ± 53b | 386 ± 85c | 334 ± 67b |
Valores promedio SD
Los valores dentro de una línea con distintos superíndices son significativamente distintos p<0,003
Polifenoles Plasmáticos
Analizamos los polifenoles plasmáticos por HPLC utilizando simultáneamente un detector electroquímico y un detector de arreglo de diodo, y estándares conocidos. En la Figura 4 se muestra la suma de algunos polifenoles identificados o detectados en plasma, para ambos grupos a distintos intervalos de tiempo.
El contenido de polifenoles plasmáticos es mayor en el grupo dieta mediterránea a los 30 y 90 días (p<0.05), mientras que a los 60 días, es decir luego de la suplementación con vino, se observa un aumento en ambos grupos alcanzando valores similares.
Daño Oxidativo al DNA
El daño oxidativo al DNA se evaluó midiendo el contenido de 8-hidroxideoxiguanosina en DNA de leucocitos de sangre periférica. El nivel de 8-OHdG en ambos grupos a distintos tiempos se muestra en la Figura 5.
Los resultados indican que una dieta rica en grasas induce daño oxidativo al DNA mientras que la dieta tipo mediterránea protege al DNA, la suplementación con vino previenen del daño y confiere una protección adicional, respectivamente 49.
Efectos de la dieta rica en grasas, dieta tipo mediterránea y suplementación con vino en el contenido de polifenoles plasmáticos. Los valores corresponden a la suma de los contenidos individuales de rutina, quercetina, acido protocatecuico y pico 4 (aún no identificado) expresados como µM equivalentes de rutina.
Valores promedio ± SD. Barras con distintas letras dentro de un mismo grupo, representan valores estadísticamente distintos, p < 0.02.
Figura 5. Efectos de la dieta rica en grasas, dieta tipo mediterránea y la suplementación con vino en el contenido de 8-OHdG en leucocitos circulantes. Los resultados se presentan como picomoles de 8-OHdG por 105 picomoles de deoxiguanosina, valores promedio ± SD. Barras con distintas letras dentro de un mismo grupo, representan valores estadísticamente distintos, p < 0.05.
Función Endotelial
La función endotelial se midió como la vasodilatación mediada por el flujo en la arteria braquial. Los resultados se expresaron como el porcentaje del cambio en el diámetro de la arteria braquial al minuto, luego de una oclusión arterial de cinco minutos en el antebrazo, en relación a medidas basales, Tabla 8.
La reactividad vascular mediada por el flujo es distinta entre los grupos durante el período sin vino. Después de la suplementación con vino las diferencias desaparecen. El grupo dieta rica en grasas muestra una completa perdida de la reactividad vascular durante el período sin vino. La suplementación con vino revierte esta disfunción, recuperándose y alcanzando valores similares a los del grupo dieta tipo mediterránea. Aun cuando el grupo dieta tipo mediterránea presenta una reactividad vascular relativamente buena, la suplementación con vino mejora aun mas la función endotelial.
Tabla 8: Efecto de la dieta rica en grasas, dieta tipo mediterránea y la suplementación con vino tinto sobre la función endotelial
| | *Vasodilatación % | |
| | Dieta sin vino | Dieta con vino |
Dieta rica en grasas | -1.00 ± 4.99 | 6.62 ± 1.96 |
| Dieta tipo mediterránea | 3.12 ± 3.94 | 5.83 ± 4.65 |
Valores promedio ± SD
*Función endotelial medida como el cambio en el diámetro de la arteria braquial mediada por el flujo sanguíneo, un minuto después de una oclusión arterial de cinco minutos en el antebrazo, en relación a medidas basales.
CONCLUSIONES
Sin duda la capacidad antioxidante del vino está directamente relacionada con su contenido en polifenoles. El tipo de polifenoles determina en ultimo término su capacidad antioxidante y su concentración cambia según variedad, área de producción, técnicas agrarias, proceso de vinificación, vendimia , año, edad, etc. La contribución de cada compuesto en particular depende no solo de su concentración y de su calidad antioxidante sino que también de su interacción con otros componentes. Numerosos estudios in vitro demuestran el efecto protector del vino sobre la oxidación de las LDL, lo que podría explicar su efecto in vivo. Los estudios de ingestión aguda demuestran que la ingestión de vino tinto esta asociada a un aumento de la capacidad antioxidante del plasma, vale decir que, en algún grado será necesario determinar, qué componentes antioxidantes del vino son absorbidos en el tubo digestivo alcanzando concentraciones plasmáticas suficientes para proteger a las LDL de la oxidación.
Los estudios de intervención a largo plazo demuestran que el consumo moderado y regular de vino eleva la capacidad antioxidante del plasma, la resistencia de las LDL a la oxidación y el contenido total de polifenoles plasmáticos. De nuestro estudio en particular, podemos agregar además, que el consumo de una dieta rica en frutas y verduras eleva por si misma la capacidad antioxidante del plasma y el contenido de polifenoles plasmáticos, factores fuertemente incrementados con la suplementación con vino.
En el estudio realizado en nuestro laboratorio se observa que una dieta rica en grasas induce daño oxidativo en el DNA, mientras que una dieta rica en frutas y verduras protege. Claramente el consumo moderado y regular de vino tinto previene el daño oxidativo al DNA inducido por una dieta rica en grasas y confiere protección adicional en una dieta rica en frutas y verduras. Estos resultados concuerdan con evidencias epidemiológicas que muestran el rol protector de frutas, verduras y vino en la reducción de ciertos tipos de cancer 50.
Nuestro estudio, además, muestra que el consumo moderado y regular de vino tinto protege la función endotelial. Cada vez hay mas evidencias que asocian disfunción endotelial con hipercolesterolemia, hipertensión, tabaquismo, diabetes y otros factores de riesgo de enfermedad cardiovascular. Se ha postulado a la disfunción endotelial como el evento primordial en la cadena de fenómenos que lleva a la formación de ateromas. La explicación causal probablemente esta relacionada con el aporte de antioxidantes, que hace el vino tinto, que protegerían al oxido nítrico, principal regulador de la función endotelial y que es producido por las células endoteliales. Los antioxidantes del vino tinto, polifenoles, particularmente flavonoides, serían los responsables de la mantención de la actividad vascular, especialmente en los individuos que ingirieron dieta grasa la que induce estrés oxidativo.
ABSTRACT
Epidemiological studies show that moderate alcohol consumption, particularly wine, is associated to decreased risk in all-causes mortality, especially ischemic heart disease death. The beneficial effect of alcoholic beverages has been attributed to the fact that ethanol raises plasma high density lipoprotein (HDL) levels and decreases blood coagulation. However, red wine has additional favorable effects presumably because of its high levels of polyphenolic compounds with antioxidants properties. Antioxidants appear as key elements in risk reduction for chronic disease in which oxidative stress plays a pathogenic role, like atherosclerosis, cancer, Alzheimer, diabetes, arthritis, etc. The antioxidant properties of phenolic compounds in red wine in retarding atherogénesis were proposed as an explanation for the French Paradox. Phenolic compounds are present especially in the skin and in the seeds of the grapes. Red wines are macerated with the skins and the seeds during the wine making process, unlike white wines. This is the main reason that the phenolic content of red wine is higher than that of white wine. The phenolic components in red wine inhibit the oxidation of human LDL in vitro and in long term moderate wine consumption studies red wine increases stability to oxidation in LDL from volunteers. Also, in human volunteers red wine increases plasma total antioxidant capacity.
In order to simultaneously evaluate the effect of polyphenols from wine and those present in a diet rich in fruits and vegetables, we performed an intervention study in human volunteers 49. For 90 days they received specially formulated and prepared diets: high-fat (40% energy from fat) poor in fruits and vegetables, or Mediterranean -like, rich in fruits and vegetables, with 27% energy from fat. From day 30 to 60 they received 240 ml/day of red wine, isocalorically substituted. A high-fat diet acts as a prooxidant. A diet rich in fruits and vegetables increases plasma antioxidant capacity and protects DNA from oxidative damage. Wine acts as a powerful antioxidant component of the diet, adding its effect to that of the diet rich in fruits and vegetables. Endothelial dysfunction, a key risk factor for atherogenesis, is maximal during the high-fat diet period, it is corrected partialy by the diet rich in fruits and vegetables, and maximal correction is observed after wine supplementation, with the two diets.
The results obtained in our diet and wine intervention study, taken together with those obtained by many others, give strong scientific support to the idea that wine is a healthy and desirable component of a well balanced diet, and that it might be a very useful protecting agent in cases when people is unable or unwilling to abandon a high-fat diet poor in fruits and vegetables. A striking number of biochemical parameters is positively modified during moderate wine consumption, our challenge is to track and define the specific agents and molecular mechanisms involved.
Palabras clave: antioxidants, catequin, cholesterol, DNA, flavonoids, quercitin, LDL, wine
BIBLIOGRAFIA
1. Antioxidantes y calidad de vida Nº 0, 1994
2. Criqui MH, Ringel BL. Does diet or alcohol explain the French paradox? Lancet 1994;344:1719-1723
3. Renaud, S., de Lorgeril, M. Wine, alcohol, platelets, and the French paradox for coronary heart disease. Lancet 1992;339:1523-1526.
4. Renaud, S., Ruf, J.C. The French paradox: vegetables or wine. Circulation 1994; 90:3118-3119
6. Kinsella, J.E., Frankel, E., German, B. and Kanner, J. Possible Mechanisms for the Protective Role of Antioxidants in Wine and Plant Foods. Food Technology 1993;85-89.
7. Conner EM, Grisham MB. Inflammation, Free Radicals, and Antioxidants. Nutrition 1996;12:274-277.
8. Rice-Evans CA, Miller NJ, Paganga G. Antioxidant properties of phenolic compounds. Trends in Plant Science 1997;2:152-159.
9. Knekt P, Järvinen R, Reunanen A, Maatela J . Flavonoid intake and coronary mortality in Finland
10. Hertog MGL, Feskens EJM, Hollman, et al. Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease: the Zutphen elderly study. Lancet 1993,342:1007-1011
11. Gerritsen, M.E., Carley, W.W., Ranges, et al. AFlavonoids inhibit cytokine-induced endothelial cell adhesion protein gene expression. Am. J. Pathol 1995; 147:278-292.
12. Muldoon, M.F., Kritchevsky, S.B. Flavonoids and heart disease. British Medical J 1996; 312:458-459
13. Wiseman H, Halliwell B Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochem 1996; J 313:17-19.
14. Infante R. Polifenoles del vino y oxidabilidad de las lipoprteínas. ¿Blanco o tinto?. Clin. Invest. Arterioesclerosis 1997;9:19-22.
15. Frankel EN, Waterhouse AL, Teissedre PL. Principal Phenolic Phytochemicals in Selected California Wines and Their Antioxidant Activity in Inhibiting Oxidation of Human Low-Density Lipoproteins. J Agric Food Chem 1995;43:890-894.
16. Price SF, Breen PJ, Vallado M, Watson BT. Wine Phenolic Responses to Cluster Sun Exposure. ASEV Tech 1994 Abstr. 4.
17. McDonald MS, Hughes M, Burns J, et al. Survey of the Free and Conjugated Myricetin and Quercetin Content of Red Wines of Different Geographical Origins. J Agric. Food Chem 1998;46:368-375.
18. Jang M, Cai L, Udeani GO, et al. Cancer Chemopreventive Activity of Resveratrol, a Natural Product Derived from Grapes. Science 1997;275:218-220.
19. Romay C, del Castillo MC, Pascual C, et al. Evaluation of the total content of antioxidants in complex mixtures. Ciencia e Cultura Journal of the Brazilian Association for the Advancement of Science 1996;48:86-95
20. Sato M, Ramarathnam N, Suzuki Y, et al. Varietal Differences in the Phenolic Content and Superoxide Radical Scavenging Potential of Wines from Different Sources. J Agric. Food Chem 1996; 44:37-41
21. Campos
22. Whitehead TP, Robinson D, Allaway S, Syms J, Hale A. (1995) Effect of Red Wine Ingestion on the Antioxidant Capacity of Serum. Clin Chem 41:32-35
23. Ghiselli A, Nardini M, Baldi A, Scaccini C. Antioxidant Activity of Different Phenolic Fractions Separated from an Italian Red Wine. J Agric Food Chem 1998;46:361-367
24. Vinson, J.A., Hontz, B.A. Phenol Antoxidant Index: Comparative Antioxidant Effectiveness of Red and White Wines. J. Agric. Food Chem 1995; 43:401-403
25. Abu-amsha R, Croft KD, Puddey IB, et al. Phenolic content of various beverages determines the extent of inhibition of serum and low-density lipoprotein oxidation in vitro: identification and mechanism of action of some cinnamic acid derivatives from red wine. Clinical Science 1996;91:449-458.
26. Caldú P, Hurtado I, Fiol C. White wine reduces the susceptibility of low-density lipoprotein to oxidation. Am J Clin Nutr 1996;63:403.
27. Hurtado I, Caldú P, Gonzalo A, et al. Antioxidative Capacity of Wine on Human LDL Oxidation in Vitro: Effect of Skin Contact in Winemaking of White Wine. J Agric Food Chem 1997;45:1283-1289
28. Leighton F, Castro C, Barriga C, Urquiaga I. Chile
29. Frankel, E.N., Kanner, J., German, et al. Inhibition of oxidation of human low-density lipoprotein by phenolic substances in red wine. Lancet 1993;341:454-457
30. Baldi A. (1996) Antioxidants in Red Wine. Wine and Human Health. Udine
31. Ursini F, Tubaro F, Rapuzzi P, Zamburlini A, Maiorino M. (1996) Wine Antioxidants: Effects in vitro and in vivo. Wine and Human Health. Udine
32. Kerry NL, Abbey M. (1997) Red wine and fractionated phenolic compounds prepared from red wine inhibit low density lipoprotein oxidation in vitro. Atherosclerosis 135:93-102.
33. Maxwell S, Thorpe G. (1996) Tea flavonoids have little short term impact on serum antioxidant activity. BMJ 313:229
34. Day AP, Kemp HJ, Bolton C, Hartog M, Stansbie D. (1997) Effect of Concentrated Red Grape Juice Consumption on Serum Antioxidant Capacity and Low-Density Lipoprotein Oxidation. Ann Nutr Metab 41:353-357.
35. Serafini M, Maiani G, Ferro-Luzzi, A. (1998) Alcohol-Free Red Wine Enhances Plasma Antioxidant Capacity in Humans. J Nutr 128:1003-1007.
36. Bravo L. Polyphenols: Chemistry, Dietary Sources, Metabolism, and Nutritional Significance. Nutr Rev 1998;56:317-333.
37. Paganga G, Rice-Evans CA
38. Hollman PC, van Trijp JM, Buysman MN
39. Gaziano JM, Buring JE, Breslow JL, et al. Moderate alcohol intake, increased levels of high-density lipoprotein and its subfractions, and decreased risk of myocardial infarction. N Engl J Med 1993;329:1829-1834
40. Lavy A, Fuhrman B, Markel A, et al. Effect of Dietary Supplementation of Red or White Wine on Human Blood Chemistry, Hematology and Coagulation: Favorable effect of Red Wine on Plasma High-Density Lipoprotein. Ann Nutr Metab 1994;38:287-294
41. Fuhrman B, Lavy A, Aviram M. Consumption of red wine with meals reduces the susceptibilty of human plasma and low-density lipoprotein to lipid peroxidation. Am J Clin Nutr 1995;61:549-554
42. Kondo, K., Matsumoto, A., Kurata, et al. Inhibition of oxidation of low-density lipoprotein with red wine. Lancet 1994;344:1152
43. de Rijke, Y.B., Demacker, P.N.M., Assen, et al. Red wine consumption does not affect oxidizability of low-density lipoproteins in volunteers. Am. J. Clin. Nutr. 1996;63:329:334
44. Nigdikar SV, Williams NR, Griffin BA, Howard AN. (Consumption of red wine polyphenols reduces the susceptibility of low-density lipoproteins to oxidation in vivo. Am J Clin Nutr 1998;68:258-265
45. Pace-Asciak CR, Rounova O, Hahn SE, et al. Wines and grape juices as modulators of platelet aggregation in healthy human subjects. Clin Chim Acta 1996;246:163-182
46. Renaud SC, Ruf JC. Effects of alcohol on platelet functions. Clin Chim Acta 1996;246:77-89
47. Demrow, H.S., Slane, P.R., Folts, J.D. Administration of wine and grape juice inhibits in vivo platelet activity and thrombosis in steriosed canine arteries. Circulation 1995;91:1182-1188
48. Ruf, J.C., Berger, J.L., Renaud, S. Platelet rebound effect of alcohol withdrawal and wine drinking in rats. Relation to tannins and lipid peroxidation. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol 1995; 15:140-144
49. Leighton F, Cuevas A, Guasch V, Plasma polyphenols and antioxidants, oxidative DNA damage, and endothelial function, in a diet and wine intervention study in humans. International Congress on Wine and Health, Florence , Italy
50. Gronbaek M, Becker U, Johansen D, et al. Population based cohort study of the association between alcohol intake and cancer of the upper digestive tract. British Med J 1998;317:844-848
AHANAOA A. C.
Lic. Nut. Miguel Leopoldo Alvarado Saldana
Fundador y presidente.
2.jpg)